中频脉冲电磁场照射骨髓间充质干细胞的拉曼光谱

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5929-5934.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.005

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中频脉冲电磁场照射骨髓间充质干细胞的拉曼光谱

崔向荣，苏伟，吴智辉，孟令晶，黄钊，覃万安

广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西壮族自治区南宁市 530021

修回日期:2014-06-10 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
通讯作者: 苏伟，教授，主任医师，广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:崔向荣，男，1983年生，山西省忻州市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事电磁场与干细胞生物学及组织工程的研究。
基金资助:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30860078; the Science and Research Program from Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 200710MS021; the Science and Research Fund from First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University

Raman spectroscopy of bone marrow mesenchymal stem cells in medium-frequency pulsed electromagnetic fields

Cui Xiang-rong, Su Wei, Wu Zhi-hui, Meng Ling-jing, Huang Zhao, Qin Wan-an

Hand Surgery, Department of Trauma Osteology, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2014-06-10 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
Contact: Su Wei, Professor, Chief physician, Hand Surgery, Department of Trauma Osteology, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Cui Xiang-rong, Studying for master’s degree, Hand Surgery, Department of Trauma Osteology, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30860078; the Science and Research Program from Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 200710MS021; the Science and Research Fund from First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University

摘要/Abstract

摘要：

背景：采用中低频脉冲电磁场干预骨髓间充质干细胞增殖分化的研究很多，但采用表面拉曼光谱方法分析受电磁场照射单个干细胞的拉曼光谱罕有报道。
目的：比较3 000 Hz中频脉冲电磁场照射与无电磁照射后存活状态下的骨髓间充质干细胞拉曼光谱的差异。
方法：分离培养鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞，取第3代细胞接种到六孔板，分为2组：无电磁组和3 000 Hz中频脉冲电磁照射组。培养7 d后，将2组细胞分别转移到生理盐水中，各取30个细胞，每个细胞收集细胞周围3个点和中间一个点的拉曼光谱，利用每组所得120个数据计算出拉曼光谱的平均相对强度，进行2组对比。
结果与结论：电磁场照射组和无电磁组骨髓间充质干细胞拉曼光谱特征峰基本相同，且origin软件作图后波形基本相同；电磁场照射组的峰值普遍较无电磁场组下降。提示激光镊子拉曼光谱技术能够应用于单个干细胞分子层面生物化学变化的检测和研究。与未经电磁场照射组相比，经3 000 Hz中频脉冲电磁场照射后，骨髓间充质干细胞的拉曼光谱有明显差异，峰值普遍降低。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 拉曼光谱, 骨髓间充质干细胞, 中频, 脉冲电磁场, 光镊, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Studies about low-frequency pulsed electromagnetic fields interfering with bone marrow mesenchymal stem cells proliferation and differentiation are many, but the Raman spectra of single stem cells irradiated in electromagnetic fields analyzed by surface Raman spectroscopy analysis are rarely reported.
OBJECTIVE: To compare the difference in Raman spectra of bone marrow mesenchymal stem cells with or with no irradiation of 3 000 Hz pulsed electromagnetic fields.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells isolated from Sprague-Dawley rats were cultured and identified. Passage 3 cells were inoculated into 6-well plates and divided into two groups: pulsed electromagnetic field irradiation group and blank control group. After cultured for 7 days, cells in the two groups were transferred to physiological saline, and 30 cells were randomly collected from each group. Four Raman spectra were harvested from each cell and the average relative intensity of Raman spectra was calculated and compared between two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: There were the same Raman peaks in the two groups, and the waveforms were basically same in the two group based on the curve mapping by origin 7.0 software. The peak value in the irradiation group was decreased compared with the blank control group. Laser optical tweezers Raman spectroscopy can be applied to study the biochemical changes of a single stem cell at the molecular level. The Raman spectra of bone marrow mesenchymal stem cells irradiated by 3 000 Hz pulsed electromagnetic fields differ from those without irradiation, and the peak also lowered after irradiation.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, electromagnetic fields, optical tweezers

中图分类号:

R394.2

崔向荣，苏伟，吴智辉，孟令晶，黄钊，覃万安. 中频脉冲电磁场照射骨髓间充质干细胞的拉曼光谱[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5929-5934.

Cui Xiang-rong, Su Wei, Wu Zhi-hui, Meng Ling-jing, Huang Zhao, Qin Wan-an. Raman spectroscopy of bone marrow mesenchymal stem cells in medium-frequency pulsed electromagnetic fields[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5929-5934.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学水平，对比观察实验。

时间及地点：于2009年3月至2010年10月在广西医科大学基础实验中心和广西科学院物理实验室完成。

材料：

实验动物：3周龄雄性SD大鼠20只，体质量50-60 g，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(桂) 2009-0002。

实验中脉冲电磁场参数：电磁场由型号为850音频理疗仪改装后发生。仪器参数：3 000 Hz、正弦波形、功率 5 W，细胞与电磁场发射源距离20 cm内，2次/d，30 min/次，间隔12 h。

激光镊子拉曼光谱实验系统如文献[14]所述，主要由型号为TE2000U倒置生物显微镜、spectraPro2300i拉曼光谱仪、Spec-10 CCD组成。

实验方法：

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与原代培养：颈脱法处死SD大鼠后立即以体积分数75%乙醇浸泡10 min消毒。眼科剪去皮取大鼠股骨、胫骨各2根，浸泡于无菌PBS平皿中，去除附着肌腱、肌肉及骨膜、眼科弯镊拔除干骺端(注：外骨膜务必刮除干净，以防外层骨膜其他细胞污染)，骨干移入无菌PBS平皿浸泡冲洗附着碎屑，一般洗涤3次基本合格。骨干投入装有无菌PBS的小青瓶，继体积分数75%乙醇喷洗灭菌小青瓶后迅速转移至无菌操作台内，取无血清L-DMEM的培养液10 mL加入平皿(无血清培养液黏度小利于将贴附于骨小梁上的间充质干细胞冲出)，眼科镊夹取小青瓶中骨干置于平皿，眼科剪中断骨干， 5 mL注射器吸取含无血清培养液从骨髓腔中冲洗出骨髓，反复冲洗至骨髓腔变成白色为止，吸管反复吹打骨髓液成细胞悬液，用200目滤网在另一平皿上过滤，以去滤渣。吸管收集滤液移入10 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加含体积分数10%胎牛血清培养液，吸管吹打液体至骨髓细胞呈均匀的悬浮液。将含体积分数10%胎牛血清的细胞悬液移至显微镜下计数板计数，调节细胞浓度至5×10⁸。分别接种细胞悬液8 mL到底面积为100 cm²玻璃培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。48 h后全量换液，加入6.5 mL L-DMEM的培养液继续培养。以后每48 h全量换液1次，每次换液后比上次加入的培养液体积减少1 mL，至5 mL止，共培养约7 d细胞即铺盖瓶底面积90%以上。

骨髓间充质干细胞具有贴壁生长的特性，随着换液次数的增多，其他具有悬浮特性及未贴壁的细胞随换液逐渐被清除，培养瓶中的骨髓间充质干细胞系在培养液所占的比例越来越大。原代骨髓间充质干细胞培养到了第7天时，骨髓间充质干细胞比例占全部细胞50%以上。

传代培养：原代培养第7天，贴壁生长的细胞覆盖瓶底面积达90%时，吸出培养液，37 ℃的PBS液15 mL涮洗2次，加入2 mL混合液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)消化30 s，3 mL含体积分数10%胎牛血清L-DMEM终止消化，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM，吹打悬浮均匀后计数，以1×10⁶/cm²浓度传代至底面积100 cm²培养瓶中，每48 h更换培养液，传代后5 d细胞铺满瓶底90%底面，此时细胞可再次传代提纯。如此一直传代骨髓间充质干细胞到第3代。

对第3代骨髓间充质干细胞进行鉴定：用化学诱导剂对骨髓间充质干细胞行成骨和成脂诱导，并且用茜素红和油红染色鉴定，电子显微镜下观察诱导后细胞形态。

电磁场照射实验：以3代细胞作为实验对象，调整3代细胞浓度到1×10⁶/cm²，接种于2组共6块预放置盖玻片的6孔板中培养7 d，3 mL/孔，每天更换新鲜培养液。6块孔板随机编号，将编号为1，3，5的3块孔板进行3 000 Hz脉冲电磁场照射作为实验组，编号为2，4，6的3块孔板作为无电磁照射的对照组。

拉曼光谱的收集：在进行拉曼光谱检测前，胰酶消化孔板细胞，将对照组和实验组的细胞分别以生理盐水洗涤，将细胞颠倒混匀，调节浓度；采样品置于厚3 mm、中心有一直径为8 mm孔的玻璃板样品槽中，下部用一厚100 μm石英片密封，上部盖上盖玻片。使用波长785 nm的激光作为拉曼光源，滤波，倒置相差显微镜的油镜对细胞进行观察，激光束经油浸物镜(N1A1 1130，×100) 聚焦后在焦点附近形成了一个单光束光势阱来囚禁细胞，同时这束激光也用来激发被囚禁细胞的拉曼散射。倒置相差显微镜进对光镊囚禁的细胞进行拍照，2组按随机原则各取30个细胞，每个细胞随机收集细胞周围3个点和中间一个点的300- 2 200 cm^-¹拉曼光谱，取样时间30 s，同样的时间每组随机取背景光谱，记录每组所得120组拉曼数据和若干背景拉曼光谱。统计学分析：由第一作者采用origin 7.0软件对数据进行分析。针对对照组、实验组有效拉曼数据求平均拉曼峰强度，最终将每组有效的120组数据转化成1组数据，数据用origin打开，生成曲线，作傅里叶变换，行平滑，去噪，分析。

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讨论

3.1 骨髓间充质干细胞的鉴定 本实验室利用体外培养的SD大鼠间充质干细胞作为实验对象，图1为对干细胞的鉴定。油红染色、茜素红染色分别鉴定出细胞具有向成骨分化和脂肪分化的能力，电子显微镜下的镜像可以看到明显的成骨细胞和脂肪细胞的特征。

3.2 显微镜下细胞 从图2可以看出，3 000 Hz脉冲电磁场照射骨髓间充质干细胞后，细胞内有色物质相对无电磁场照射的对照组有所减少，但是镜下差别不是很明显。

3.3 拉曼光谱 光镊和激光拉曼光谱技术测量得到的散射物质的拉曼频移，是物质分子转动和振动能级特性的表征。通过对物质的拉曼光谱分析，可以从分子结构上了解物质的构成、特性及其变化规律^[2-6]。单细胞光镊拉曼光谱技术是将光学囚禁(optical trapping)与拉曼光谱分析(Ramanspectroscopy)结合并应用于悬浮细胞研究的一项生物光子技术。其原理是利用高度会聚的激光束，囚禁(光镊作用)溶液中的活细胞，使之固定在激光微束中，再通过瞬时增加的激光强度来激发生命大分子的拉曼散射，收集该细胞的拉曼光谱。本实验即将单细胞光镊拉曼光谱技术应用到分析干细胞在不同培养条件下的研究中^[6^，^19-21]。

将本实验所得拉曼图谱与邹祖全等^[22]研究的臭氧对胎牛血清氧化损伤的表面增强拉曼光谱的结论进行对比，发现二者拉曼图谱曲线以及拉曼特征峰兼相差甚远，说明本实验所得骨髓间充质干细胞拉曼光谱几乎没有残留的胎牛血清信号，说明本实验所得拉曼光谱数据确是骨髓间充质干细胞的数据。

由图3可直观地看出：①对照组、实验组细胞的拉曼光谱特征峰形态基本一致。②对照组拉曼光谱峰值普遍较实验组小。分析图3和表1可知：①对照组、实验组细胞的拉曼光谱特征峰主要对应的是氨基酸、脂类、核酸的基团。②对照组、实验组拉曼数据同时出现了Hydroxyapatite特征峰(966，1 206)，hydoxyproline特征峰(1 206)，这2个峰代表的羟基磷灰石/胶原都是形成骨骼组织的必须成分，说明骨髓间充质干细胞具有成骨分化的潜力^[23-26]。

二硫键S-S的伸缩振动对它所处的构象非常敏感，骨髓间充质干细胞拉曼光谱中二硫键的特征峰525 cm^-¹是2组拉曼光谱中出现的第一个极明显的峰，表明了肽链在此处的扭曲-扭曲-反式结构^[23]；电磁场照射后此峰强下降了42.01%，二硫键是肽链内或肽链间2个半胱氨酸的巯基氧化而成的键，是维持蛋白质空间构象的重要共价键。二硫键不仅能稳定天然蛋白质的构象，且还能引导进一步氧化和折叠的发生。二硫键与蛋白质高级结构的生物活性有关，同时与蛋白质的复性也有关联^[24-25]。如核糖核酸酶A经巯基乙醇(还原剂)和尿素(蛋白质变性剂)处理后，发生变性作用，4对二硫键断裂，多肽链伸展开来，高级结构发生变化，失去生物活性。如果用透析法将大量还原剂和变性剂除去，在微量还原剂存在下，4对二硫键在原来的位置重新形成，伸展开的多肽链会自发折叠成天然构象，生物活性得到恢复。次试验也证明蛋白质高级结构的信息存在于一级结构中^[26-29]。

酪氨酸特征峰621，827，830，851，1 602，1 616- 1 617，其中851和830是对羟苯环的呼吸振动和环平面外弯曲振动倍频之间费米振动的表征，对侧链微环境改变的变化明显。对照组、实验组细胞拉曼光谱I851/I830>>1，说明酪氨酸残基绝大部分是暴露的，但实验组比值较对照组小，说明电磁场照射使暴露在蛋白质表面的酪氨酸残基数减少，而“埋藏”的酪氨酸残基数相对增加^[29-31]。

苯丙氨酸特征峰1 001，1 602 cm^-¹等，色氨酸特征峰756，760 cm^-¹等特征峰都较为明显；亦有一些是混合物质的特征峰，如1078 cm^-¹等是脂类C-C、C-O振动峰，也是核酸C-C、PO₂伸缩振动峰，1 257 cm^-¹等对应的是酰胺Ⅲ、胞嘧啶、腺嘌呤等，1 302 cm^-¹等代表的脂类，1 367 cm^-¹等峰代表了包括鸟嘌呤、酪氨酸相关蛋白、脂类物质等丰富的生物活性信息；1 439 cm^-¹等峰是对照组、实验组细胞峰值最高的峰，代表着干细胞含量丰富的脂类物质； 1 656 cm^-¹等是蛋白质C=Oa-螺旋拉账振动峰，也是脂类C=C键伸缩振动峰。

从图标和拉曼数据分析发现，代表Ca²⁺拉曼波峰的381，1 017 cm^-¹，1 395 和1 443 cm⁻¹等波谱位置并没有出现明显的拉曼峰特征^[8]，说明干细胞在没有化学试剂诱导的情况下不会自发的向成骨细胞分化，3 000 Hz电磁场在为期7 d的照射对骨髓间充质干细胞也并没有显示出促进Ca²⁺富集的作用。

从图4可看出，脉冲电磁场照射的干细胞得到的拉曼光谱，其峰值普遍降低。下降较明显的谱带有525，808- 1 062，1 257-1 500 cm^-¹等，其中一些波谱位置如525， 1 001，1 062，1 257，1 367，1 439，1 652 cm^-¹等代表相关物质的峰值降低程度尤为突出。

综合以上分析，由拉曼数据显示的干细胞信息可以知道，干细胞具有分化成为成骨细胞的潜力，存活状态的骨髓间充质干细胞含有丰富的生命物质。本实验中的SD大鼠骨髓间充质干细胞受到3 000 Hz脉冲电磁场照射后，蛋白质、脂类、核酸等均有不同程度的减少。尤其是峰强度绝对值下降最大的1 367峰，更是说明了3 000 Hz脉冲电磁场对干细胞DNA、RNA等遗传物质的结构和数量产生了分子水平的影响。本实验中并未发现3 000 Hz脉冲电磁场显示出具有增加干细胞细胞膜蛋白的直接表现^[30-31]。

3.4 结论 利用共聚拉曼光谱和光镊结合的单细胞技术得到的拉曼数据，能够在分子层面上区分SD大鼠骨髓间充质干细胞受到3 000 Hz脉冲电磁场照射和未经照射后发生的变化；3 000 Hz脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞产生了分子层面的影响。利用拉曼光镊技术检测骨髓间充质干细胞在电磁场照射后蛋白质、脂类、核酸等结构和数量的变化是可行的，3 000 Hz的脉冲电磁场对干细胞分子层面的短期影响是不良的，长期影响有待进一步的观察。鉴于活体细胞受到脉冲电磁场辐射时间远远比本实验中脉冲电磁场时间要长，中频段脉冲电磁场对活体细胞的长远影响，也需要进一步的实验佐证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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